植物病毒脫除技術與原理!!!

植物病毒脫除技術與原理

 

 

 

 

 

多數農作物，尤其無性繁殖的植物，易受病菌侵染。最嚴重的如草莓，能感染62種病毒和類菌原體，因此須常更新母株。蘭花同樣易感染病毒，這也是蘭花外銷主要障礙之一。要除去植物病毒最好的方法是利用種子繁殖，原因是大部份病毒不能通過種子來傳播。可這方法對蘭花生產不合適，因為有保持品質需要，現行蘭花繁殖多採用分生苗。如何利用組織培養技術來進行蘭花脫毒，才是現實可行的方案。

脫毒技術的產生源自於人們對病毒在植物體內分佈不均勻的認識。1940年人們就發現根莖頂端分生組織與植物其他部分相比病毒含量較低，後來就有人嘗試將莖尖頂端無毒部分切下，通過組織培養的辦法進行繁殖。利用這樣方法Morel等人1952-1955年獲得了大麗花、天竺葵、馬鈴薯無毒植株。雖然如此，有些植物品種頂端分生組織仍有病毒，莖尖脫毒難以奏效。後來，1956年Thomas採用分生組織與熱處理相結合的方法，脫毒效率大為提高。到1970年代，植物原生質體培養技術的發展，又為植物脫毒技術提供了新的途徑。
一  脫毒技術及其原理

 （1）莖尖（根尖）組織培養脫毒法莖尖（根尖）培養之所以能脫毒，是因為植物幼嫩的新生組織與器官中病毒含量較低，生長點前端0.1-1.5mm區域內幾乎不含病毒或含量很少。這種現象有多種可能的原因，一種可能是莖尖（根尖）分生組織中胞間連絲發育不完全，病毒在細胞間的擴散受阻; 再者可能是植物莖尖（根尖）細胞分裂過快，病毒復製、擴散速度趕不上莖尖生長速度，結果莖尖（根尖）頂端細胞沒有病毒; 還有原因可能是莖尖（根尖）分生細胞有抑制、鈍化病毒的物質，或者是缺少病毒增殖感受點。莖尖培養脫毒方法是在解剖鏡下，用鋒利的解剖刀準確地切取莖尖（根尖），然後將莖尖（根尖）分生組織進行離體培養，再結合病毒檢測，就可以獲得無病毒的植株。莖尖培養中最主要的影響因素就是切取莖尖（根尖）的大小，一般要求莖尖（根尖）長度小於1mm。技術上通常切取莖尖（根尖）越小，脫毒效果越好，但是莖尖（根尖）培養成活率變低。

（2）莖尖微芽嫁接脫毒對一些組培困難的植物，莖尖截取太小培養不易成功。新的變通方法是在試管中將莖尖嫁接在無毒的砧木上，進行試管培養，癒合成完整的脫毒植株。這種方法在柑橘、蘋果、葡萄等有較多應用。

（3）熱處理法熱處理脫毒是根據病毒與植物細胞對高溫的忍耐程度不同，將苗木、接穗或種子放在適當的溫度下處理一段時間，將植物組織中病毒部分地或完全地鈍化而控制其的活動，但很少傷害甚至不傷害植物組織，從而讓植物細胞繼續保持活力加快生長，使生長點附近不帶病毒，從而達到脫毒的目的。熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，鈍化病毒，其過程很復雜，與很多因素有關。其中，病毒對溫度敏感性、寄主植物的保衛反應均有可能起一定的作用。熱處理法中，最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡或濕熱空氣進行。熱水浸泡對休眠芽效果較好，濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果較好，既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進行，把旺盛生長的植物移入到1個熱療室中，在35~40℃下處理一段時間即可，處理時間的長短，可由幾分鐘到數月不等。熱處理的方法有恆溫處理和變溫處理，處理的材料可以是植株，也可以是接穗。有些植物對高溫敏感，可用冷處理代替熱處理結合莖尖培養來脫毒。如三葉草，將植株放在10^oC中經過一段時間培養，再取莖尖脫毒培養。同樣方法也有人用於消除馬鈴薯梭狀塊莖類病毒。

 （4）抗病毒藥劑法

目前尚無一種藥劑能完全消除植物體內病毒，但可用一些抗病毒藥劑影響病毒RNA的複製形成，幹擾病毒的正常生長，從而達到在組織培養中除去病毒的目的。Ribavirin是人工合成的對DNA病毒或RNA病毒有廣譜作用的一種抗病毒醚，有被用來清除蘋果中CLSV病毒。另外常用的抗病毒化學藥物有三氮唑核苷（病毒唑），5-二氫尿嘧啶（DHT）和雙乙醯-二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加到植株生長的培養基上。這種方法一般要與莖尖培養相結合應用。經過抗病毒藥劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進行組織培養，就會提高脫毒率和成活率。採用病毒抑制劑與莖尖培養相結合的脫毒方法，可以較容易的脫除多種病毒，而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大於1mm，易於分化出苗，提高存活率。很多植物病毒用一種方法難以奏效，實際工作中常常是幾種方法相互結合。如使用化學藥劑和熱處理結合，可提高脫除病毒的效果。其他有效方法，如利用種子、花藥、胚珠部分，培養無毒苗，對蘭花不適用，這裡不作介紹。
二  脫毒效果的檢測方法
盡管我們在脫毒過程中，做了很多清除病毒的處理，取莖尖時也足夠小心，培育出的苗木也仍然可能夾帶有病毒植株。糟糕的是很多植物病毒有一個滯後的復甦期，你很難在小苗期辨別出來。因此，一個有效病毒檢測方法是脫毒成功的重要保證。檢驗植物病毒方法隨生物科技進步不斷改進。最簡單方法是檢查葉和莖是否有病毒特有的症狀。因症狀出現可能要經過相當長的時間才能表現出來，人們就選擇一些對待檢病毒敏感的植物作為指示植物，然而將受檢植物汁液塗抹在指示植物的傷口上，即進行病毒的汁液傳染，傳染過的指示植物經過培養，會較快地顯示病毒症狀。對蘭花而言，多項調查報告顯示，感染情況最普遍，對全球蘭花產業影響最嚴重的，為蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）。這兩種病毒相應的常用指植物為紅藜和千日紅，症狀為紅色或黃色斑點。這就是常說的生物鑑定法。指示植物法簡便易行，成本低，但它靈敏性差，所需時間長，難以區分病毒種類，況且還有一些植物病毒長期潛伏不表現出症狀，這就需要血清法、電鏡法、PCR技術。抗血清鑒定法要進行抗原的製備(包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的採收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶中，貯存在–15~–25℃的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物汁液在小試管內混合，這一反應導致形成可見的沉澱，然後根據沉澱反應來鑒定病毒。此法靈敏度高，獲得檢測結果迅速，是目前檢測病毒的一種好方法。島內已有酵素連接抗體，可進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）免疫測定（ELISA法），結果準確可靠。血清學反應，如果植物體內病毒含量較低，則靈敏度不夠。近年來迅速發展的PCR技術則可以檢測很少量病毒分子。對那些已知其核酸序列的病毒，可以人工合成特異的引子，通過PCR快速擴增目標病毒基因，迅速確定病毒存在與否。幸運的是進行蕙蘭嵌紋病毒(CyMV)及齒舌蘭輪斑病毒（ORSV）PCR測定的引子國外已有公開發表，只要一個簡單實驗室即可完成。此外，PCR微量板雜交法、蛋白質電泳法、嫁接檢測法、 電子顯微鏡檢定法等也可以用來檢測植物病毒，限於篇幅不在這裡介紹。當然，上述三種方法正確運用，可以有效地幫助我們篩選出無病毒的蘭花植株。
三  無病毒原種的保存
無病毒植株不具備額外的抗病毒能力，它們在污染環境中有可能會很快再次感染病毒。為避免再次感染應對溫室和栽培介質進行消毒滅菌。大規模繁殖育苗時，應該種植在與其他苗木相隔離的區域內，使該區域很少或完全沒有重新感染的機會。通過脫毒檢驗的原種可進行離體培養，長期保存繁殖。通過莖尖培養得到的植株一般不發生或較少有變異，但還是應該檢查脫毒苗木是否保持了原有的遺傳品質。病毒脫除是保持蘭花種質的一項重要工作，我們可共同合作，克服這個蘭花發展的障礙，讓臺灣蘭花有更廣闊國際市場。